Identifizierung einer Immuninfiltration

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14153 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Atherosklerose ist eine chronische, lipidbedingte Entzündungsreaktion des angeborenen und adaptiven Immunsystems und für mehrere kardiovaskuläre ischämische Ereignisse verantwortlich. Ziel der vorliegenden Studie war es, immuninfiltrationsbezogene Biomarker in atherosklerotischen Plaques (CAPs) der Halsschlagader zu bestimmen. Genexpressionsprofile von CAPs wurden aus der Gene Expression Omnibus-Datenbank extrahiert. Differenziell exprimierte Gene (DEGs) zwischen den CAPs und Kontrollgruppen wurden mit dem „limma“-Paket in der R-Software gescreent. Die Infiltration von Immunzellen zwischen den CAPs und den Kontrollgruppen wurde durch die Anreicherungsanalyse einzelner Proben-Gensätze bewertet. Die wichtigsten infiltrierenden Immunzellen in der CAPs-Gruppe wurden mit dem Wilcoxon-Test und der geringsten absoluten Schrumpfung sowie der Selektionsoperator-Regression gescreent. Die gewichtete Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse wurde verwendet, um mit Immunzellen in Zusammenhang stehende Gene zu identifizieren. Hub-Gene wurden durch das Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) identifiziert. Eine Analyse der Betriebskennlinie des Empfängers wurde durchgeführt, um die Fähigkeit des Gens zu beurteilen, zwischen den CAPs und Kontrollgruppen zu unterscheiden. Schließlich haben wir mithilfe der ENCODE-Datenbank ein miRNA-Gen-Transkriptionsfaktor-Netzwerk von Hub-Genen aufgebaut. Zwischen den CAPs und den Kontrollgruppen wurden elf verschiedene Arten von Zellen identifiziert, die mit der Immuninfiltration in Zusammenhang stehen. Durch Kreuzung zwischen DEGs und immunbezogenen Genen wurden insgesamt 1.586 unterschiedlich exprimierte immunbezogene Gene erhalten. Zwanzig Hub-Gene wurden über das PPI-Netzwerk gescreent. Schließlich wurden 7 Gene (BTK, LYN, PTPN11, CD163, CD4, ITGAL und ITGB7) als Hub-Gene von CAPs identifiziert, und diese Gene könnten als geschätzte Wirkstoffziele für Patienten mit CAPs dienen.

Die chronische Ansammlung von lipidgetriebenen Plaques in der subendothelialen Intima der Arterien führt schließlich zu einer erheblichen Stenose des Lumens, einer unzureichenden Durchblutung und einer kritischen Hypoxie des Gewebes1. Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Erkrankungen der peripheren Arterien und zerebrovaskuläre Erkrankungen werden häufig durch Arteriosklerose verursacht. Atherosklerotische Plaques (CAPs) der Karotis sind auch die häufigste zugrunde liegende Pathologie eines ischämischen Hirnschlags. Frühere Studien haben unser Verständnis der Ätiologie der Arteriosklerose erheblich verbessert. Allerdings mangelt es immer noch an klinischer Praxis, um grundlegende wissenschaftliche Erkenntnisse direkt am Krankenbett des Patienten umzusetzen2. Daher besteht die Notwendigkeit, Hub-Gene zu filtern, um Patienten mit CAPs von Kontrollpersonen zu unterscheiden.

Der Schlüsselmechanismus der Arterioskleroseentwicklung ist eine Immunantwort auf eine lipidbedingte Entzündung in der subendothelialen Intimaschicht der Arterien. Entzündliche Makrophagen und die Bildung von Schaumzellen während der Plaqueprogression spielen eine besonders wichtige Rolle bei der Atherogenese und wurden bereits ausführlich untersucht1,3. Angeborene und adaptive Immunzellen tragen zur Entstehung arterieller chronischer Entzündungen bei4. Eine abnormale Verteilung und unpassende Arten von Immunzellen sind ebenfalls mit der Atherogenese verbunden5. Daher könnte die Erforschung verschiedener Veränderungen von Immunzellen bei der Atherogenese neue Einblicke in die Ätiologie, Diagnose und Behandlung von CAPs liefern.

Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (HTS), zum Beispiel Microarray, RNA-Sequenzierung und Einzelzellsequenzierung, generieren umfangreiche Genexpressionsdaten, die für die Untersuchung der Verteilung von Immunzellen in Läsionsgeweben geeignet sind6,7. Die Identifizierung von Typen, Zusammensetzung und Funktionszuständen von Zellen bei der Atherogenese ist entscheidend für das Verständnis des zellulären Beitrags8,9,10. Genexpressionsprofilierung; Beispielsweise könnten Microarray- und RNA-Sequenzierung verwendet werden, um differentiell exprimierte Gene (DEGs) und Signalwege zu identifizieren, die an der Atherogenese beteiligt sind11,12. Durch die Kombination mit Sequenzierungstechniken könnte die bioinformatische Analyse die Beziehungen zwischen DEGs und Atherogenese aufklären und das Interaktionsnetzwerk von Hub-Genen, heterogener nuklearer RNA (hnRNA), Transkriptionsfaktoren (TFs), microRNAs (miRNAs) und Proteinen veranschaulichen13,14.

In der vorliegenden Studie wurden die Microarray-Daten aus Gene Expression Omnibus (GEO)-Datensätzen heruntergeladen und der Single Sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA)-Algorithmus wurde verwendet, um die Häufigkeit und Typen von Immunzellen zwischen den CAPs und Kontrollgruppen zu bewerten. Wir haben auch die mit der Immuninfiltration in Zusammenhang stehenden Hub-Gene bei Patienten mit CAPs identifiziert.

GEO ist ein internationales öffentliches Repository für von Forschern hinterlegte Mikroarray- und sequenzfunktionale Genomdatensätze. Die Genexpressionsdatensätze GSE43292 und GSE100927 wurden für die differenzielle Genanalyse zwischen den CAPs und den Kontrollgruppen verwendet. Insgesamt 32 CAPs, die aus Endarteriektomiegewebe gewonnen wurden, und 32 makroskopisch intakte Karotisgewebe neben den CAPs wurden in GSE43292 einbezogen. In GSE100927 waren insgesamt 29 CAPs und 12 normale Gewebe der Halsschlagader enthalten. Der Datensatz GSE43292 wurde als Erkennungssatz verwendet, während der Datensatz GSE100927 zur Validierung verwendet wurde.

Das „limma“-Paket in der R-Software15 wurde verwendet, um die differenzielle Expression von mRNAs durchzuführen. Der angepasste P-Wert, der mithilfe der Methode von Benjamini und Hochberg (BH) angepasst wurde, wurde zur Korrektur falsch positiver Ergebnisse in GSE43292 verwendet. Alle DEGs (angepasster p-Wert < 0,001) zwischen den CAPs und den Kontrollgruppen wurden für die weitere Analyse ausgewählt.

Um die potenziellen biologischen Funktionen von DEGs zu bewerten, wurden eine Signalweganreicherungsanalyse der Gene Ontology (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) unter Verwendung des Pakets „clusterProfiler“16,17 durchgeführt. Funktionskategorien mit einem angepassten P-Wert von < 0,05 (angepasst nach der Methode von Benjamini und Hochberg (BH)) wurden als signifikante Pfade angesehen.

Der Infiltrationsgrad von Immunzellen (aktivierte B-Zellen, aktivierte CD4 + T-Zellen, aktivierte CD8 + T-Zellen, aktivierte DCs, natürliche Killerzellen CD56bright, natürliche Killerzellen CD56dim, CD4 + T-Zellen des zentralen Gedächtnisses, CD8 + T-Zellen des zentralen Gedächtnisses, Effektorgedächtnis-CD4+-T-Zellen, Effektorgedächtnis-CD8+-T-Zellen, Eosinophile, Gamma-Delta-T-Zellen, unreife B-Zellen, unreife DCs, Makrophagen, Mastzellen, myeloische Suppressorzellen (MDSCs), Gedächtnis-B-Zellen, Monozyten, natürlich Killerzellen, natürliche Killer-T-Zellen, Neutrophile, plasmazytoide DCs, regulatorische T-Zellen, follikuläre T-Helferzellen, T-Helferzellen vom Typ 1, T-Helferzellen vom Typ 17 und T-Helferzellen vom Typ 2) wurde durch den ssGSEA-Algorithmus im „ GSVA“-Paket der R-Software18. Der Hintergrund-Gensatz wurde aus der vorherigen Literatur18 zusammengestellt. Der ssGSEA-Algorithmus definierte einen Score, der den Grad der absoluten Anreicherung verschiedener Immunzell-Gensätze in jeder Probe darstellt. Die Unterschiede in der Immunzellinfiltration zwischen den CAPs und den normalen Gruppen wurden mit dem Wilcoxon-Test analysiert (P < 0,05). Die charakteristischen Immunzellen, die zur Unterscheidung zwischen Krankheits- und Kontrollproben verwendet werden konnten, wurden mithilfe der Regressionsanalyse des kleinsten absoluten Schrumpfungs- und Auswahloperators (LASSO) gescreent. Das Merkmal der LASSO-Regression besteht darin, dass bei der Erstellung des verallgemeinerten linearen Modells der Datenbedarf äußerst gering ist und sie daher weit verbreitet ist. Durch die Durchführung einer Regressionsstrafe auf alle Variablen wird der Koeffizient relativ unwichtiger Variablen zu 0, was von der Modellierung ausgeschlossen wird. Anschließend werden unabhängige Variablen mit großem Einfluss auf abhängige Variablen ausgewählt und der entsprechende Regressionskoeffizient berechnet. Abschließend werden wichtige Merkmale herausgefiltert. Die sich überschneidenden Immunzellen der beiden Methoden wurden als Schlüsselimmunzellen der CAPs für die nachfolgende Studie extrahiert.

Das R-Paket „WGCNA“ wurde verwendet, um wichtige infiltrierende Immunzellen-bezogene Module und Gene zu finden19. Zunächst wurde ein hierarchisches Clustering der CAPs durchgeführt, um Ausreißer zu erkennen und zu beseitigen. Als nächstes haben wir die Funktion pickSoftThreshold verwendet, um eine weiche Schwellenleistung β gemäß standardmäßigen skalenfreien Netzwerken zu finden. Die Nachbarschaften zwischen allen gefilterten Genen wurden unter Verwendung der Power-Adjacence-Funktion zur Pearson-Korrelationsmatrix berechnet, um Daten in eine topologische Überlappungsmatrix (TOM) umzuwandeln, und die entsprechende Unähnlichkeit (1-TOM) wurde berechnet. Anschließend wurde die Unähnlichkeit der Modul-Eigengene berechnet, um das Modul weiter zu analysieren.

Die DEIRGs wurden durch Kreuzung von Modulgenen und DEGs erhalten. Das PPI-Netzwerk der DEIRGs wurde unter Verwendung der STRING-Datenbank20 mit dem minimal erforderlichen Interaktionswert von 0,7 (höchstes Vertrauen) erstellt. Anschließend wurde das Kernmodul des PPI-Netzwerks mit dem Cytoscape-Software-Plugin Molecular Complex Detection (MCODE)21 mit den folgenden Standardparametern gescreent: Grad-Cutoff = 2, Node-Score-Cutoff = 0,2 und K-Score = 2. Die Gene in Das Kernmodul wurde als Hub-Gen betrachtet.

Die Analyse der Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve ist eine bewährte Methode zur Beurteilung, wie gut ein Marker in der Lage ist, zwischen Personen, bei denen eine Erkrankung auftritt, und Personen, bei denen dies nicht der Fall ist, zu unterscheiden. Die ROC-Kurve wurde aufgezeichnet und die Fläche unter der Kurve (AUC) mit dem „pROC“-Paket der R-Software22 berechnet, um die Fähigkeit der ausgewählten Hub-Gene zur Unterscheidung zwischen CAPs und Kontrollgruppen zu bewerten.

Korrelationskoeffizienten zwischen den Genen wurden durch Spearmans Korrelationskoeffizientenanalyse unter Verwendung des „corrplot“-Pakets der R-Software23 berechnet. Darüber hinaus wurde die funktionelle Ähnlichkeit zwischen den Genen mithilfe des geometrischen Mittels semantischer Ähnlichkeiten in Zellkomponenten (CC) und molekularen Funktionen (MF) über das Paket „GOSemSim“24 bestimmt. Um die Beziehung zwischen Hub-Genen und Immunzellen weiter zu untersuchen, haben wir auch die Korrelation zwischen Hub-Genen und unterschiedlich infiltrierenden Immunzellen analysiert.

Die Krankheitsontologie (DO) annotiert menschliche Gene im Kontext der Krankheit. Das „DOSE“-Paket der R-Software25 wurde verwendet, um die DO-Anreicherung der diagnostischen Gene zu analysieren. DO-Terme mit signifikanter Anreicherung wurden auf der Grundlage des an den Schwellenwert angepassten P-Werts von <0, 05 gescreent. Die Drug Gene Interaction Database (DGIdb) ist eine Ressource für Arzneimittel-Gen-Interaktionen26. Wir durchsuchten die DGIdb-Datenbank, um potenzielle Arzneimittel oder molekulare Verbindungen vorherzusagen, die mit den diagnostischen Genen interagierten, und visualisierten das Arzneimittel-Gen-Interaktionsnetzwerk mit der Cytoscape-Software.

miRNAs oder TFs steuern die Genexpression durch Interaktion mit ihren Zielgenen während der posttranskriptionellen oder transkriptionellen Phase. Der konkrete Implementierungsprozess wurde durch die miRnet-Datenbank (https://www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml) erreicht, die bei der Erstellung von TF-Vorhersagen die Hintergrunddatenbank auswählen konnte. Daher wurde die ENCODE-Datenbank verwendet, um miRNAs und TFs vorherzusagen, die mit den Hub-Genen interagierten21. Wir haben das miRNA-Gen-TF-Netzwerk mithilfe der Cytoscape-Software visualisiert.

Im Vergleich zu normalen Gruppen wurden in CAPs insgesamt 2.378 DEGs (1.248 hochregulierte und 1.130 herunterregulierte) identifiziert (Abb. 1A). Die Expression von DEGs bei Patienten mit CAPs und normalen Gruppen wird in einer Heatmap dargestellt (Abb. 1B). Um die möglichen molekularen Mechanismen dieser DEGs zu untersuchen, führten wir GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen durch.

Identifizierung und Anreicherungsanalyse von DEGs. (A) Vulkankarte der DEGs. Die blauen Punkte stellen Gene dar, die in den CAPs deutlich herunterreguliert wurden, die roten Punkte stellen Gene dar, die in den CAPs deutlich hochreguliert waren. (B) Wärmekarte von DEGs. Die Ordinate stellt die Proben dar und die Abszisse stellt die DEGs dar. Die Heatmaps wurden von pheatmap (1.0.12 Kolde R (2019). _pheatmap: Pretty Heatmaps_. R Paketversion 1.0.12, < https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap > .) (C ) GO-Analyse der biologischen Funktionsanreicherung herunterregulierter Gene. (D) KEGG-Signalweganreicherungsanalyse herunterregulierter Gene. (E) GO-Analyse der biologischen Funktionsanreicherung hochregulierter Gene. (F) KEGG-Signalweganreicherungsanalyse herunterregulierter Gene.

In Bezug auf die herunterregulierten Gene ergab die GO-Analyse, dass die primären Funktionskategorien in den biologischen Prozessen (BP) „Muskelsystemprozess“, „Muskelkontraktion“ und „Wnt-Gewebeentwicklung“ waren. Für die zelluläre Komponente (CC) waren die wichtigsten angereicherten GO-Begriffe „Zell-Zell-Verbindung“, „kontraktile Faser“ und „Myofibrille“. Die am stärksten angereicherten Begriffe der molekularen Funktion (MF) waren „Aktinbindung“, „Calmodulin“ und „struktureller Bestandteil des Muskels“ (Abb. 1C). Die Analyse der Anreicherung des KEGG-Signalwegs ergab, dass die DEGs hauptsächlich an der „Regulation des Aktin-Zytoskeletts“, der „fokalen Adhäsion“, dem „Calcium-Signalweg“ und der „Kontraktion der glatten Gefäßmuskulatur“ beteiligt waren (Abb. 1D).

In Bezug auf die hochregulierten Gene ergab die GO-Analyse, dass die primären Funktionskategorien bei BP „T-Zell-Aktivierung“, „positive Regulierung der Zytokinproduktion“ und „Immunantwort-regulierender Signalweg“ waren. Für die zelluläre Komponente (CC) waren die wichtigsten angereicherten GO-Begriffe „Vakuolenmembran“, „lytische Vakuolenmembran“ und „lysosomale Membran“. Die am stärksten angereicherten MF-Begriffe waren „GTPase-Regulatoraktivität“, „Nukleosidtriphosphatase-Regulatoraktivität“ und „GTPase-Aktivatoraktivität“ (Abb. 1E). Die Analyse der Anreicherung des KEGG-Signalwegs ergab, dass die DEGs hauptsächlich an „Lysosom“, „Tuberkulose“ und „Chemokin-Signalweg“ beteiligt waren (Abb. 1F).

Da die Immunmikroumgebung eng mit dem Ausbruch und dem Fortschreiten der Krankheit zusammenhängt, führten wir eine Immuninfiltrationsanalyse durch. Zunächst wurde das GSVA-Paket verwendet, um die ssGSEA-Scores von 28 verschiedenen Arten von Immunzellen in jeder Probe zu berechnen. Als nächstes verglichen wir die Infiltration von Immunzellen zwischen CAPs und normalen Gruppen. Abbildung 2A zeigt den Infiltrationsgrad der Immunzellen in CAPs und normalen Gruppen. Um die Ergebnisse für die absolute Anreicherung verschiedener Immunzell-Gensätze in jeder Probe zu vergleichen, sind die Ergebnisse des Wilcoxon-Tests in Abb. 2B dargestellt, die 27 Arten von Immunzellen mit einem P-Wert von < 0,05 zeigte. Anschließend wurde vom R-Paket glmnet eine logistische LASSO-Regressionsanalyse durchgeführt, um charakteristische Immunzellen zwischen AP- und normalen Proben zu vergleichen. Die Ergebnisse von LASSO sind in Abb. 2C, D dargestellt, die 11 Arten von Immunzellen zeigt, die als Signaturzellen von CAPs verwendet werden könnten. Die differenziellen Immunzellen aus dem Wilcoxon-Test und die Signaturimmunzellen aus der LASSO-Regression wurden gekreuzt, und 11 Immunzellen wurden erhalten und als Schlüsselimmunzellen von CAPs verwendet; Dazu gehörten aktivierte B-Zellen, aktivierte CD8+-T-Zellen, CD56-helle natürliche Killerzellen, zentrale Gedächtnis-CD8+-T-Zellen, Effektor-Gedächtnis-CD4+-T-Zellen, Effektor-Gedächtnis-CD8+-T-Zellen, Eosinophile, Gamma-Delta-T-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen, Monozyten und natürliche Killer-T-Zellen. Diese waren in CAPs deutlich höher als in normalen Gruppen.

Infiltrierende Immunzellanalyse. (A) Wärmekarte der Infiltration von Immunzellen. Die Abszisse stellt die Probe und die Ordinate den Immunzelltyp dar (N = 28). Die Farbe stellt die Menge (oder Aktivität) der Immunzellen in jeder Probe dar. Die Heatmaps wurden von pheatmap (1.0.12 Kolde R (2019). _pheatmap: Pretty Heatmaps_. R Paketversion 1.0.12, < https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap > .) (B ) Boxplot der Immunzellinfiltration zwischen CAPs und Kontrollgruppen. Die Abszisse repräsentiert den Typ der Immunzellen und die Ordinate den ssGSEA-Score. Das blaue Kästchen stellt die Kontrollgruppen dar und das rote Kästchen stellt die CAPs dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die Grafik zeigt, dass sich nur die 27 Arten von Immunzellen deutlich unterscheiden. (C)(D) Differenzielle Immunzellen wurden durch den LASSO-Algorithmus identifiziert.

Um Gene zu untersuchen, die mit den wichtigsten infiltrierenden Immunzellen assoziiert sind, wurde das Koexpressionsnetzwerk mithilfe einer gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA) erstellt. Zunächst wurde der euklidische Abstand der Genexpression verwendet, um eine hierarchische Gruppierung von Proben durchzuführen, und die Ausreißerdaten wurden ausgeschlossen (Abb. 3A, B). Anschließend wurden unter Verwendung der Soft-Thresholding-Leistung von 12 insgesamt 12 Module identifiziert (Abb. 3C, D). Um die Beziehung zwischen Modulen und infiltrierenden Immunzellen weiter zu bewerten, wurden Modul-Merkmal-Korrelations-Wärmekarten erstellt (Abb. 3E). Wir beobachteten, dass die Korrelationen zwischen blauen und braunen Modulen und 11 differenziellen Immunzellen größer waren als bei anderen Modulen (Abb. 3E). Folglich wurden 3.719 Modulgene in den blauen und braunen Modulen für weitere Studien als immunbezogene Gene betrachtet.

Entdeckung der immunbezogenen Module und Gene. (A) Beispiel-Clustering-Baum. Die Gesamtzahl der Proben betrug N = 64 und die Ausreißerprobe GSM1060144 musste entfernt werden. (B) Probenclusterbaum nach dem Entfernen von Ausreißerproben. Die Gesamtzahl der Stichproben beträgt N = 63. (C) Filtern des weichen Schwellenwerts. Stellen Sie den weichen Schwellenwert auf 12 ein. (D) Hierarchischer Clusterbaum. Der obere Teil der Abbildung stellt die Clusterung von Genen dar, der untere Teil stellt Genmodule dar, die insgesamt 12 Module bilden, und das graue Modul stellt Gene dar, die nicht in Module klassifiziert sind. (E) Modul – Merkmalskorrelations-Heatmap. Die Werte in den Quadraten stellen die Pearson-Korrelationskoeffizienten und die entsprechenden p-Werte dar, die paarweise zwischen Merkmalen und Modulen berechnet werden. Die Heatmaps wurden von WGCNA 1.71 Langfelder P und Horvath S, WGCNA erstellt: ein R-Paket für die gewichtete Korrelationsnetzwerkanalyse. BMC Bioinformatics 2008, 9:559 https://doi.org/10.1186/1471-2105-9-559, http://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/.

Die erhaltenen 3.719 immunbezogenen Gene und 2.378 DEGs wurden gekreuzt, und insgesamt wurden 1.586 DEIRGs erhalten (Abb. 4A). Der PPI wurde mit 1.586 DEIRGs mithilfe der STRING-Datenbank analysiert (Abb. 4B). Das gesamte PPI-Netzwerk wurde mit MCODE analysiert, woraufhin die Gene im Kernmodul als Hub-Gene ausgewählt wurden (Abb. 4C). Schließlich wurden 20 Hub-Gene identifiziert, nämlich ITGB7, PTPN11, CD68, JAM3, ITGA8, ITGAE, IL10, ITGAL, ITGA4, ITGA9, CD4, CD1C, PTPRC, CD163, TNF, BTK, CD86, MRC1, LYN und CD80 . Der PPI der 20 Hub-Gene ist in Abb. 4D dargestellt.

Identifizierung von Hub-Genen durch das PPI-Netzwerk. (A) Venn-Diagramm der Schnittmenge von DEGs und immunbezogenen Genen. Der grüne Bereich stellt DEGs dar, der rote Bereich stellt immunbezogene Gene dar und die Überlappung stellt DEIRGs dar (N = 1586). (B) Protein-Interaktionsnetzwerk. Knoten repräsentieren unterschiedlich exprimierte circadian verwandte Proteine. Die Linie zwischen den Knoten zeigt an, dass zwischen ihnen eine Interaktion besteht. (C) MCODE1-Score = 9,368. Wählen Sie alle Gene in diesem Modul (Top1) als Schlüsselgene (N = 20) aus. (D) Der PPI von 20 Hub-Genen.

Zunächst wurden die Expressionsniveaus der Hub-Gene visualisiert. Das Expressionsniveau von ITGB7, CD68, ITGAE, IL10, ITGAL, ITGA4, CD4, CD1C, PTPRC, CD163, TNF, BTK, CD86, MRC1, LYN und CD80 war höher und das Expressionsniveau von PTPN11, JAM3, ITGA8, und ITGA9 war bei Patienten mit CAPs niedriger (Abb. 5A). Als nächstes erstellten wir ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) für die Hub-Gene und berechneten die entsprechenden AUC-Werte (Area Under the Curve) (Abb. 5B). Die Ergebnisse zeigten, dass die AUCs der Hub-Gene (BTK, LYN, PTPN11, CD163, CD4, CD68, ITGAL, ITGB7 und ITGAE) größer als 0,8 waren. Die Expressionsniveaus der Hub-Gene wurden im Validierungsdatensatz GSE100927 weiter überprüft (Abb. 5C). Es gab 19 Hub-Gene (außer CD86) mit ähnlichen Expressionstrends wie im Entdeckungssatz. Wie in Abb. 5D gezeigt, lagen die AUC-Werte der 18 Hub-Gene (außer CD86 und ITGAE) ebenfalls über 0,7. Somit wurden die validierten 18 Hub-Gene, nämlich ITGB7, PTPN11, JAM3, ITGA8, IL10, ITGAL, ITGA4, ITGA9, CD4, CD1C, PTPRC, CD163, TNF, BTK, CD68, MRC1, LYN und CD80, ausgewählt Es wurde festgestellt, dass diese Gene die Fähigkeit besitzen, zwischen CAPs und Kontrollgruppen zu unterscheiden.

Überprüfung von Hub-Genen. (A) Boxplot der differentiellen Expressions-Hub-Gene zwischen CAPs und Kontrollgruppen im Entdeckungsdatensatz. (B) ROC-Kurvenvalidierung basierend auf der Expression von Schlüsselgenen im Entdeckungsdatensatz. Der AUC-Wert stellt die Fläche unter der Kurve dar. (C) Boxplot der differentiellen Expressions-Hub-Gene zwischen CAPs und Kontrollgruppen im Validierungsdatensatz. (D) ROC-Kurvenvalidierung basierend auf der Expression von Schlüsselgenen im Validierungsdatensatz.

Um die Korrelationen zwischen den Hub-Genen zu demonstrieren, haben wir Abb. 6A erstellt. Es wurde festgestellt, dass die Gene CD80, ITGA4, CD1C, PTPRC, MRC1, CD68, CD163, BTK, CD4, LYN, ITGAL, ITGB7, IL10 und TNF positiv miteinander korrelieren. Darüber hinaus korrelierten auch die Gene ITGA9, PTPN11, JAM3 und ITGA8 positiv miteinander. Allerdings korrelierten die Gene CD80, ITGA4, CD1C, PTPRC, MRC1, CD68, CD163, BTK, CD4, LYN, ITGAL, ITGB7, IL10 und TNF negativ mit den Genen ITGA9, PTPN11, JAM3 und ITGA8. Der Vergleich funktioneller Ähnlichkeiten von Genen oder Genprodukten ist ein wichtiger Inhalt der biowissenschaftlichen Forschung, der ein breites Anwendungsspektrum bei der funktionellen Vorhersage biologischer Makromoleküle, der Genclusterung, der Analyse biologischer Netzwerke und dem Screening krankheitsbezogener Gene hat. Die Berechnung der funktionellen Ähnlichkeit zwischen Genen ist zur Grundaufgabe der Bioinformatikforschung geworden. Daher haben wir die Hub-Gene nach der durchschnittlichen funktionellen Ähnlichkeit eingestuft. Abbildung 6B zeigte, dass ITGAL, ITGB7 und ITGA4 die drei wichtigsten Hub-Gene waren und möglicherweise eine Schlüsselrolle bei CAPs spielen.

Expressionskorrelation, funktionelle Ähnlichkeit und Immunzellkorrelationsanalyse der Hub-Gene. (A) Diagramm des Korrelationskoeffizienten der Hub-Genexpression. (B) Funktionelle Ähnlichkeit von Hub-Genen. Die Abszisse stellt den funktionellen Ähnlichkeitswert des Gens dar, die Ordinate stellt den Gennamen dar und verschiedenfarbige Bins repräsentieren unterschiedliche Gene. (C) Wärmekarte der Assoziation zwischen Hub-Genen und differenziellen immuninfiltrierenden Zellen. Die Heatmaps wurden von ggcorrplot 0.1.4 Kassambara A (2022) erstellt. _ggcorrplot: Visualisierung einer Korrelationsmatrix mit 'ggplot2'_. R-Paketversion 0.1.4, https://CRAN.R-project.org/package=ggcorrplot.

Darüber hinaus müssen wir den Zusammenhang zwischen den Hub-Genen und unterschiedlich infiltrierenden Immunzellen klären. Das Ergebnis der Korrelationsanalyse zwischen den Hub-Genen und differenziell infiltrierenden Immunzellen zeigte, dass die Gene ITGB7, IL10, ITGAL, ITGA4, CD4, CD1C, PTPRC, CD163, TNF, BTK, CD68, MRC1, LYN und CD80 positiv korrelierten mit unterschiedlich infiltrierenden Immunzellen, während die Gene PTPN11, JAM3, ITGA8 und ITGA9 negativ mit unterschiedlich infiltrierenden Immunzellen korrelierten (Abb. 6C).

Um die Rolle von DEGs bei anderen Krankheiten zu untersuchen, zeigte die Disease Ontology (DO)-Analyse, dass die Hub-Gene hauptsächlich in „lymphoblastischer Leukämie“, „Human Immunodeficiency Virus-Infektionskrankheit“, „Multiple Sklerose“ und anderen Begriffen angereichert waren ( Abb. 7A). Um nach potenziellen therapeutischen Arzneimitteln zu suchen, führten wir eine Analyse zum Screening kleiner Moleküle durch. Wie im Arzneimittel-Gen-Interaktionsnetzwerk (Abb. 7B) gezeigt, wurden insgesamt 191 Arzneimittel oder molekulare Verbindungen, die 11 Hub-Genen entsprechen, aus der DGIdb-Datenbank abgerufen. Cyclosporin könnte 4 Hub-Gene regulieren, nämlich CD80, IL10, ITGAL und TNF. Darüber hinaus regulierten 68 Medikamente oder molekulare Verbindungen, darunter Alteplase und Atorvastatin, das TNF-Gen.

DO-Anreicherungsanalyse der Hub-Gene und Identifizierung potenzieller Medikamente. (A) DO-Anreicherungsblasendiagramm. Es werden nur die zehn häufigsten Krankheitstypen angezeigt. (B) Diagramm des Gen-Arzneimittel-Interaktionsnetzwerks, die Linie zwischen den beiden zeigt eine Interaktion an.

Um die Pfade von Hub-Genen zu untersuchen, haben wir ein regulatorisches Netzwerk für miRNA-Gen-Transkriptionsfaktoren (TF) aufgebaut, indem wir die regulatorischen Wechselwirkungen zwischen miRNAs/TFs und den Hub-Genen in der ENCODE-Datenbank ermittelt haben (Abb. 8). Insgesamt waren 384 Knoten (18 Hub-Gene, 311 miRNAs und 55 TFs) und 549 Kanten im miRNA-Gen-TF-Netzwerk enthalten. Die fünf wichtigsten miRNAs, die die meisten Hub-Gene regulierten, waren hsa-mir-155-5p, hsa-mir-7-5p, hsa-mir-1291, hsa-mir-328-3p und hsa-mir-551b. 15 Uhr. Die fünf regulierenden Gene SP1, NFKB1, SPI1, RELA und CREB1 rangierten unter den TFs am höchsten. LYN, PTPN11 und TNF waren die drei wichtigsten Hub-Gene, auf die miRNAs abzielten, und IL10 und TNF70 waren die beiden wichtigsten Hub-Gene, auf die TFs abzielten.

Aufbau des miRNA-Gen-TF-Regulierungsnetzwerks. Hub-Gen – TFs – mirNA-Regulierungsnetzwerk. Der rote Bereich stellt das Hub-Gen dar, der grüne Bereich stellt die TFs dar, der violette Bereich stellt die miRNA dar und Linien zeigen das Vorhandensein einer regulatorischen Beziehung an.

CAPs sind eine der Hauptursachen für Schlaganfälle27. Die durch Plaque-Ruptur entstehenden Emboli sind hauptsächlich für den Verschluss von Hirngefäßen verantwortlich. Daher sind das Screening von Hub-Genen bei Patienten mit Schlaganfallrisiko und die Bestimmung möglicher immuntherapeutischer Ziele für CAPs von entscheidender Bedeutung für die Prävention zerebrovaskulärer unerwünschter Ereignisse28. Um die Hub-Gene von CAPs zu identifizieren, haben wir die koregulierten DEGs im CAPs-bezogenen Datensatz GSE43292 analysiert. Mithilfe integrierter bioinformatischer Methoden wurden 11 deutlich unterschiedliche Arten von Immunzellen zwischen den CAPs und den Kontrollgruppen identifiziert, und 7 Hub-Gene (BTK, LYN, PTPN11, CD163, CD4, ITGAL und ITGB7) könnten als potenzielle Biomarker zur Unterscheidung dienen CAPs und Kontrollproben. Obwohl in der Literatur mehrere immunbezogene Signaturen vorgeschlagen wurden, schlagen wir zum ersten Mal neuartige immuninfiltrationsbezogene Biomarker bei Atherosklerose der Halsschlagader vor.

Frühere Studien haben DEGs mithilfe des GEO-Datensatzes gescreent29,30,31. Unterschiedliche Methoden und Kriterien haben zu unterschiedlichen Ergebnissen für DEGs geführt. Chen et al. untersuchten 335 hochregulierte Gene und 81 herunterregulierte Gene. Basierend auf dem GSEA-Einzelgen waren die mit Entzündung und Immunantwort korrelierten Gensätze in der Gruppe mit hohem Expressionsniveau von NCF2, IQPAG2 und CD8629 stark hochreguliert. Liu et al. erhielten 758 DEGs und stellten fest, dass die Gene ITGAM und ACTN2 im PPI-Netzwerk ein hohes Maß an Expression aufwiesen31. Liu et al. identifizierten 680 hochregulierte Gene und 875 herunterregulierte Gene in Plaque-Proben. Das Gen IGFBP6 ist in instabilen CAPs herunterreguliert; Daher könnte es ein wichtiges Molekül bei der Bildung instabiler Plaques sein30. Ji et al. untersuchten Veränderungen der Darmmikrobiota und Plasmametaboliten bei Patienten mit CAPs und Kontrollgruppen mithilfe ribosomaler DNA-Sequenzierung und Metabolomik. Unter 132 DEGs zeigte das Gen FABP4 den höchsten |log2(fold change)|32. Diese Studien identifizierten nur DEGs zwischen stabilen und instabilen Plaques; Unsere Forschung hat jedoch DEGs zwischen den CAPs und Kontrollgruppen identifiziert, was überzeugend und wertvoll ist.

Wang et al. identifizierte Schlüsselgene, die am Fortschreiten von CAPs beteiligt sind, mithilfe des Immune Cell Abundance Identifier (ImmuCellAI). Sie zeigten, dass T-Zellen und myeloische Zellen einen großen Anteil der atherosklerotischen Immunzellen ausmachen und dass Makrophagen und dendritische Zellen (DCs) unterschiedliche Anreicherungen in den CAPs und Kontrollgruppen aufwiesen13. Mithilfe von WGCNA konnten Zhao et al. entdeckten ein altersassoziiertes Gen als Biomarker für CAPs, und In-vitro-Experimente legen nahe, dass das Gen CEBPB an der Progression von CAPs beteiligt ist33. Ziel der oben genannten Studien war es, die Veränderung der Häufigkeit von 24 Immunzelltypen in atherosklerotischen Geweben zu beschreiben; Im Gegensatz zu früheren Forschungen wollten wir jedoch unterschiedliche Gene identifizieren, die mit der Veränderung der Häufigkeit von Immunzellen verbunden sind.

Die vorliegende Studie ist die erste, die ssGSEA, Wilcoxon-Test, LASSO-Regressionsmodell und WGCNA kombiniert, um die wichtigsten infiltrierenden Immunzellen und Gene zwischen den CAPs und Kontrollgruppen zu identifizieren, und schlägt immuninfiltrationsbezogene Biomarker für CAPs vor.

Durch die Analyse der Immuneigenschaften von CAPs fanden wir signifikante Unterschiede für 11 Immunzellen (aktivierte B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen, Gamma-Delta-T-Zellen, natürliche Killer-T-Zellen, aktivierte CD8+-T-Zellen, zentrale Gedächtnis-CD8+-T-Zellen, Effektor). Gedächtnis-CD8+-T-Zellen, Effektor-Gedächtnis-CD4+-T-Zellen, natürliche Killerzellen, Eosinophile und Monozyten) zwischen den CAPs und Kontrollgruppen, was darauf hindeutet, dass angeborene und adaptive Immunsysteme eine entscheidende Rolle bei der Förderung chronischer Entzündungen spielen, die mit CAPs in Zusammenhang stehen Arterienwand. Zytotoxische T-Zellen (CD8 + T-Zellen), natürliche Killer-T-Zellen (NKT), NK-Zellen und Gamma-Delta-T-Zellen gehören zu den wichtigsten Arten von Killerzellen34,35. Alle Killerlymphozyten sind über verschiedene Methoden wie Zytotoxin-, FasL/TRAIL- und/oder Zytokin-abhängige Mechanismen am CAPs-Prozess beteiligt, der schließlich den Prozess des Zerreißens der CAPs abschließt36,37. Killerzellen sind in instabilen Plaques reichlich vorhanden, was ihre Rolle beim Bruch von CAPs und ihre Beteiligung am Fortschreiten der Arteriosklerose der Halsschlagader verstärkt. Die verschiedenen Arten von B-Zellen (B1 und B2) haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Entwicklung von CAPs. Beispielsweise produzieren B1-Zellen IgM-Antikörper und zeigen eine atheroprotektive Wirkung, während B2-Zellen IgG- und IgE-Antikörper absondern, die die Entwicklung von CAPs fördern38. Daher spekulieren wir, dass die Immunität eng mit CAPs zusammenhängt und die immuntherapeutischen Wirkungen bei Patienten mit CAPs durch Killer-Lymphozyten-bezogene Mechanismen beeinflussen kann.

Unter den von MCODE auf der Grundlage des DEG-Koexpressionsnetzwerks untersuchten Schlüsselgenen zeigten die Gene LYN und BTK die bemerkenswerteste Konnektivität. Bei einer hohen durchschnittlichen funktionellen Ähnlichkeit könnten die Gene ITGAL und ITGB7 eine entscheidende Rolle im Interaktionsnetzwerk spielen. Die ROC-Kurve dieser Gene zeigte, dass die AUC-Werte 0,854, 0,852, 0,851, 0,843, 0,844, 0,827 und 0,825 für LYN, BTK, PTPN11, CD4, CD163, ITGAL und ITGB7 betrugen.

LYN, ein Mitglied der Protein-Tyrosinkinasen, verwaltet in erster Linie grundlegende zelluläre Prozesse wie Zellwachstum und -differenzierung durch Hemmung der Immunaktivierung durch die Rekrutierung hemmender Proteine und Lipidphosphatasen39. Frühere Studien haben gezeigt, dass LYN sowohl positive als auch negative Wege der B-Zell-bezogenen Immunität reguliert40. LYN ist außerdem ein entscheidender Regulator der Signalwege des Immunrezeptors und fördert sowohl proinflammatorische als auch unterdrückende Signalwege in Immunzellen (z. B. Neutrophilen, DCs, Monozyten und Makrophagen) und B-Lymphozyten41. Dies stimmt auch mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie überein, dass es sich bei den 11 differenziellen Immunzellen hauptsächlich um B-Lymphozyten und angeborene Immunzellen handelt.

BTK ist erforderlich, um Signalwege zu aktivieren, die das Überleben von Lymphozyten fördern42, und um die Sekretion von Chemokinen und den B-Zell-Adhäsionsprozess durch Aktivierung der Phospholipase Cg2 (PLCg2)43 zu regulieren. Darüber hinaus scheint BTK eine Schlüsselrolle bei der angeborenen Immunität zu spielen, indem es viele Immunsignalnetzwerke des angeborenen Immunsystems moduliert44. BTK ist auch wichtig für die Neutrophilenentwicklung45 und für die NLRP3-Inflammasom-Aktivierung in Makrophagen46 und DCs47. Wir fanden auch heraus, dass die Gene BTK und LYN mit 0,94 die höchste Expressionsähnlichkeit aufwiesen, was darauf hindeutet, dass diese beiden Gene wahrscheinlich den gleichen Effekt auf die Entwicklung von CAPs haben.

CD4 ist ein Membranglykoprotein, das auf Helfer-T-Lymphozyten exprimiert wird und mit Immunglobulinmolekülen fast aller Klassen und Unterklassen interagiert48. In sklerotischen Plaques wurde in verschiedenen Stadien von CAPs eine Infiltration von T-Lymphozyten festgestellt, wobei CD4+-Effektor-T-Lymphozyten die wichtigsten sind49,50. CD4 + T-Zellen sind die Hauptmediatoren von CAPs und an allen Stadien atherosklerotischer Erkrankungen beteiligt. Chemokinrezeptoren (z. B. CCR5 und CXCR6) vermitteln die Infiltration von T-Zellen in die CAPs51,52.

CD163 wird ausschließlich in Monozyten (geringe Expression) und Makrophagen (hohe Expression)53 exprimiert. IL-6, IL-10 und andere entzündungshemmende Zytokine induzieren die CD163-Expression, während IL-4, TNF-α, IFN-γ und andere Entzündungsfaktoren die CD163-Expression hemmen54. Es scheint offensichtlich, dass nur eine Teilpopulation von M2s CD163 + ist; Daher wird CD163 häufig als M2-Marker55 verwendet. Eine hohe Expression von CD163 in Makrophagen ist ein Merkmal entzündlicher Gewebe. Frühere Studien haben gezeigt, dass Glukokortikoide eine entzündungshemmende Wirkung auf Makrophagen haben, indem sie deren Phänotyp beeinflussen und so die Expression von Zytokinen regulieren56.

Protein-Tyrosin-Phosphatase N11 (PTPN11), auch bekannt als Src-Homologie-2-Domäne-enthaltende Protein-Tyrosin-Phosphatase 2 (SHP2), ist eine wichtige Protein-Tyrosin-Phosphatase (PTP), die eine wesentliche Rolle bei mehreren zellulären Ereignissen spielt, einschließlich Zellmigration, Differenzierung, Überleben und Stoffwechsel57. Chen J et al. fanden heraus, dass die Hemmung der Aktivität von SHP2 die Entwicklung von CAPs verhindern könnte, indem sie die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen hemmt58.

Integrin β7 (ITGB7) wird auf der Oberfläche von Leukozyten exprimiert und spielt eine wesentliche Rolle bei der Suche nach Immunzellen59. Frühere Studien haben gezeigt, dass ITGB7 in Zellen des multiplen Myeloms (MM) konstitutiv aktiviert wird und eine bemerkenswerte Anti-MM-Wirkung aufweist60. ITGB7 bindet an Integrin α4 und bildet Integrin α4β7, einen heterodimeren Zelloberflächenrezeptor, der auf den meisten Leukozyten exprimiert wird61. Integrin α4β7 ist an mehreren Schritten während der Atherogenese bei Mäusen beteiligt, und die Hochregulierung von Integrin α4β7 ist mit dem Fortschreiten atherogener Läsionen verbunden62.

Lymphozytenfunktionsassoziiertes Antigen-1, auch LFA-1 oder αLβ2 genannt, ist ein zentrales T-Zell-Integrin zur Regulierung der T-Zell-Aktivierung und -Migration63. Bisher gibt es jedoch keine Studien, die einen direkten Einfluss von ITGAL auf das Fortschreiten von CAPs belegen. Frühere Studien haben gezeigt, dass ITGAL die Bildung von Schaumzellen in Makrophagen beeinflusst, indem es die Ac-LDL-Aufnahme reguliert64.

Die Ergebnisse der DO-Anreicherungsanalyse der diagnostischen Gene zeigten, dass diese Gene bei Tuberkulose, Infektionskrankheiten mit dem humanen Immundefizienzvirus und primären Immundefizienzkrankheiten signifikant angereichert waren. CD4 ist der Rezeptor des HIV-Hüllproteins gp120; Daher kann HIV selektiv CD4 + T-Zellen infizieren und AIDS verursachen. Frühere Studien legen nahe, dass der Phänotyp von Makrophagenpopulationen das Fortschreiten der Tuberkulose und den Infektionsausgang im Zeitraum von der frühen Infektion bis zur Granulombildung weitgehend beeinflussen kann65. Der M2-Phänotyp umfasst mehrere Formen nicht klassisch aktivierter Makrophagen mit entzündungshemmenden, angiogenen und Th2-gerichteten immunmodulatorischen Eigenschaften. Frühere Studien kamen zu dem Schluss, dass menschliche Monozyten während einer aktiven Tuberkuloseinfektion dazu neigen, sich in entzündungshemmende (M2-ähnliche) Makrophagen zu differenzieren, die eine verbesserte Protease-abhängige Motilität, ein verbessertes Überleben von Krankheitserregern und immunmodulatorische Eigenschaften aufweisen66.

In der vorliegenden Studie haben wir das DGIdb auch verwendet, um mehrere niedermolekulare Arzneimittel mit potenzieller therapeutischer Wirksamkeit gegen CAPs zu testen. Einige von ihnen, wie Imatinib, haben nachweislich eine krebshemmende Wirkung bei der Behandlung von chronischer myeloischer Leukämie und gastrointestinalen Stromatumoren67. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass Imatinib Hyperlipidämie verringern und normalisieren kann, was darauf hindeutet, dass Imatinib die Entwicklung von CAPs abschwächen kann. Daher könnten diese identifizierten niedermolekularen Arzneimittel ein erhebliches Potenzial haben, das Fortschreiten von CAPs zu hemmen68.

Die vorliegende Studie weist einige Einschränkungen auf. Erstens ist die Verwendung von drei Proben zur Validierung der ROC-Analyse unzureichend. Zweitens haben wir aufgrund der geringen Anzahl von Datensätzen, die für diese Studie geeignet waren, nur Microarray-Datensätze anstelle von RNA-seq- und Einzelmolekül-Sequenzierungsdatensätzen ausgewählt. Unsere zukünftige Forschung wird sich darauf konzentrieren, die Lücke in diesem Bereich zu schließen. Drittens haben wir nur die Gene analysiert, die möglicherweise mit CAPs in Zusammenhang stehen, ohne die Lokalisierung der Zellsubtypen eingehend zu analysieren. Wir planen die Durchführung einer neuen Studie, in die mehr Patienten und mehrere Arten von Datensätzen aufgenommen werden, um die Zuverlässigkeit der Hub-Gene zu überprüfen.

Zusammenfassend haben wir zum ersten Mal 7 immunbezogene Differenzierungsgene zwischen CAPs und normalen Proben der Halsschlagader identifiziert, darunter BTK, LYN, PTPN11, CD163, CD4, ITGAL und ITGB7; Dieser Befund könnte für das Verständnis des Prozesses von CAPs von entscheidender Bedeutung sein und als potenzielle Ziele für die Immuntherapie dienen. In Zukunft werden wir die Genauigkeit unserer Ergebnisse durch entsprechende Experimente an klinischen Gewebeproben weiter überprüfen.

Die Datensätze sind in der GEO-Datenbank verfügbar. GSE43292 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi), GSE100927 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi).

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Wir bedanken uns für die Unterstützung durch die Abteilung für Gefäßchirurgie des Beijing Chaoyang Hospital und Guo-Jiang Zhao, Abteilung für Urologie, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hualiang Ren und Chunmin Li.

Abteilung für Gefäßchirurgie, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Peking, China

Kai Zheng, Wentao Yang, Shengxing Wang, Mingsheng Sun, Zhenyi Jin, Wangde Zhang, Hualiang Ren und Chunmin Li

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KZ, HR und CL haben die Studie entworfen. KZ und WY führten eine bioinformatische Analyse durch. KZ, WY, SW und MS haben das Manuskript verfasst. CL, HR und WZ trugen zur Überarbeitung des Manuskripts bei. Alle Autoren stimmten dem endgültig eingereichten Manuskript zu.

Korrespondenz mit Hualiang Ren oder Chunmin Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zheng, K., Yang, W., Wang, S. et al. Identifizierung von Immuninfiltrations-bezogenen Biomarkern in atherosklerotischen Plaques der Karotis. Sci Rep 13, 14153 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40530-w

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Eingegangen: 26. Dezember 2022

Angenommen: 11. August 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40530-w

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